Инструкция на Холестерин ФКД
ХОЛЕСТЕРИН-ФКД
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения концентрации общего холестерина колориметрическим энзиматическим методом
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для количественного определения общего холестерина в плазме и сыворотке крови человека энзиматическим колориметрическим методом в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике.
Набор рассчитан на проведение 200 определений при расходе 1,0 мл рабочего реагента на 1 анализ и пригоден для различных вариантов микроанализа.
ПРИНЦИП МЕТОДА
При гидролизе эфиров холестерина холестеринэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и свободный холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярного количество перекиси водорода: последний под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в анализируемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 500 (490–540) нм.
СОСТАВ НАБОРА
Ферментно-хромогенная смесь: (…………………….) – 10 таблеток.
Детергент: 10% р-р тритон Х-100, 1 мл – 1 флакон.
Калибратор: калибровочный раствор холестерина, 5,17 ммоль/л (200 мг/дл), 1 мл – 1 флакон.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Набор обеспечивает линейность при определении холестерина в диапазоне концентраций от 2,0 до 25,0 ммоль/л, отклонение от линейности – не более 5%. Чувствительность – не более 0,5 ммоль/л. Коэффициент вариации – не более 5%.
Стабильность окраски не менее 1 часа.
Для проверки правильности определений рекомендуется использовать отечественные или зарубежные контрольные сыворотки, аттестованные данным методом.
Нормальные величины содержания холестерина в сыворотке и плазме крови человека – 3,5–6,9 ммоль/л,
Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента людей.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Ферментно-хромогенная смесь содержит токсичные компоненты. В случае попадания ее раствора на кожу и(или) слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством воды. Пипетирование per os категорически запрещается. Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
При работе с сывороткой или плазмой крови необходимо соблюдать правила техники безопасности принятые в лаборатории, т.к. образцы человеческой крови следует рассматривать как потенциально инфицированые.
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ОТХОДОВ
Проводить в соответствии с местными правилами.
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Негемолизированная сыворотка крови. Гепаринизированная или ЭДТА плазма.
Сыворотку и плазму крови получают обычным образом. Стабильность образцов
1 день при 20-25 °С
3 дня при 4-8 °С
3 месяца при -20 °С
ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
– Спектрофотометр, длина волны 500нм, или фотоэлектроколориметр, (490–540) нм, кювета с длиной оптического пути 10 или 5 мм;
– пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,025–2,0 мл;
– флаконы или пробирки вместимостью 5-10 мл;
– секундомер;
– колбы мерные вместимостью 100 или 200 мл;
– пробирки стеклянные вместимостью 10 мл;
– термостат, поддерживающий температуру +37±1° С;
– вода дистиллированная.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
Приготовление рабочего реагента: 10 таблеток ферментно-хромогенной смеси поместить в мерную колбу вместимостью 200 мл. Добавить 150 мл дистиллированной воды и 0,4 мл раствора детергента. Тщательно перемешать до полного растворения таблеток, избегая вспенивания раствора. Довести объем дистиллированной водой до метки. Допускается наличие мелких нерастворенных частиц. В случае их появления, раствору дать отстояться и его аккуратно перелить в чистую емкость. Перенести рабочий реагент в посуду из темного стекла.
Полученный рабочий реагент можно хранить в темном месте в плотно укупоренной посуде при температуре (+2–8° С) не более 7 дней.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Внести в пробирки анализируемые образцы сыворотки или плазмы крови и реагенты по следующей схеме:
Отмерить, мл | Опытная проба | Калибровочная проба | Холостая проба |
Сыворотка (плазма) крови | 0,01 | - | - |
Калибровочный раствор холестерина | - | 0,01 | - |
Вода дистиллированная | - | - | 0,01 |
Рабочий реагент | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
*При работе на фотоколориметре с кюветой с длиной оптического пути 5 мм или 3мм отношение сыворотки к рабочему реагенту должно составляет 1:100.
Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 25 мин при комнатной температуре (+18–25° С) или в течение 15 мин при температуре +37° С.
После окончания инкубации измерить величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 (490–540) нм.
Окраска проб стабильна в течение 1 ч. после окончания инкубации при условии предохранения от прямого воздействия солнечных лучей.
РАСЧЕТЫ
Расчет концентрации глюкозы в анализируемых пробах провести по формуле:
Eо
С = --------- x 5,17 ,
Eк
где: С – концентрация холестерина, ммоль/л;
Eо – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;
Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;
5,17 – концентрация холестерина в калибраторе, ммоль/л.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре +25° С не более 5 суток.
Срок годности набора – 12 месяцев.
Рабочий реагент можно хранить при температуре +2–8° С в посуде из темного стекла не более 7 дней при условии достаточной герметизации.
Калибратор после вскрытия флакона плотно укупоренный можно хранить при температуре +2–8° С в темном месте не более 2 месяцев.